果酒是用水果本身的糖分被酵母菌发酵成为酒精的酒,含有水果的风味与酒精。因此民间的家庭时常会自酿一些水果酒来饮用。 一、前言果酒酿造是一个复杂的生物工程,酿造微生物种类繁多。不同酒种生长的微生物也不尽相同,不同的原料自身会带有不同的菌群,这些菌群自始至终参与酒的发酵,不同的菌群发酵代谢的产物也各不相同,这些产物给发酵的质量、风格带来了重大影响。桑椹为多年生木本植物,其成熟果子果肉多汁、皮薄娇嫩。而由于桑棋富含多种营养物质,加之采摘期间高温潮湿,成熟果易腐烂、霉变,从而造成发酵的污染及陈酿酒的感染等,因此会改变桑椹酒风味,并破坏发酵酒的生物稳定性,损害发酵酒的品质。因此,研究与鉴定污染桑椹果酒的微生物种,查找发酵酒的污染源,了解污染微生物的代谢规律,找出有效控制果酒被污染的方法,对提高桑椹酒的品质及企业经济效益具有十分重要的意义。二、桑椹发酵酒污染菌的分离鉴定方法1.材料与方法1.1 主要仪器设备T-200型电子天平,752紫外光栅分光光度计,电热恒温培养箱,电热鼓风干燥箱,可控硅控温水浴锅,电子调温万用电炉,光学双筒显微镜,高速组织捣碎机,微生物净化室,手提式灭菌锅,JYT-架盘药物天平,旋涡混合器,酒精计,精密pH计,家用冰箱。1.2 样品的采集宁波天宫庄园果汁果酒有限公司被污染的发酵酒,分别从33#、42#、88#、107#罐取出。1.3 培养基1.3.1 细菌培养基(1)MRS培养基:蛋白胨10g,牛肉膏10g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,吐温-80 1g,磷酸氢二钾2g,乙酸钠5g,柠檬酸三铵2g,MnSO4.H2O 0.2g,MgSO4·7H2O 0.04g,琼脂20g,pH6.3,蒸馏水1000mL。(2)营养琼脂培养基(NA):蛋白胨10g,牛肉膏3g,氯化钠5g,琼脂20g,pH 7.2—7.4,蒸馏水1000mL。(3)WLN培养基:葡萄糖50g,酵母提取物4g,蛋白胨5g,FeCl3·6H2O 0.0025g,KCl 0.425g,MgSO4·7H2O 0.125g,MnSO4 0.0025g,CaCl2·2H2O 0.125g,琼脂20g,pH5.5—5.8,蒸馏水1000mL。1.3.2 真菌用培养基(1)土豆培养基(PDA):200g土豆切碎后,加800mL水,100℃煮沸1h后,用一层纱布过滤,然后加入20g葡萄糖,最后用蒸馏水定容到1000mL。(2)察氏培养基(CPK):NaNO3 3g,K2HPO4 1g,KCl 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,FeSO4·7H2O 0.01g,蔗糖30g,蒸馏水1000mL。1.4 平板分离培养方法(1)稀释分离:取数支无菌空试管排列于试管架上,根据待稀释的浓度分别依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,并向试管中各加入9mL无菌生理盐水。用1mL无菌吸管精确吸取1mL已充分混匀的待测酒样,注入10-1试管中。然后,另取1支无菌吸管,于10-1试管中来回吹吸三次,使之混匀,即成10-1稀释液。再从10-1试管中吸1mL注入10-2试管中,重复上述操作,直至制成10-2、10-3、10-4、10-5稀释液。(2)倾注平板:取无菌培养皿若干套,每3套为一组,在每组皿底分别写上稀释度,再用对应的1mL无菌吸管分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释液各1mL,对应放入编好号的无菌培养皿中,尽快向上述盛有不同稀释度菌液的平皿中倒入融化后冷却至45℃—50℃左右的培养基,每皿约15mL,置水平位置迅速旋转平皿,使培养基与菌液混合均匀,而又不使培养基荡出或溅到皿盖上,待培养基凝固。(3)涂布平板:用对应的1mL无菌吸管分别吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5稀释液各0.1mL,对应放入已编好号的预先制备好的空白平板中,迅速用无菌玻璃涂布棒(将玻璃涂布棒沾取酒精,在酒精灯火焰上灼烧,在培养皿上盖上冷却后使用)将稀释菌液均匀地涂抹在整个培养基的表面,至稀释液完全被吸收。(4)培养:倒置于恒温培养箱中培养(细菌用37℃,真菌用30℃),观察菌落形态和分散状况,挑取单菌落转接斜面。(5)计数:数各皿中的菌落数,算出同一稀释度3个平皿上菌落的平均数,按照计数报告原则计算结果。